KDM5Bの喪失はATF3発現をエピジェネティックに増強することにより病的な心臓線維症と機能不全を改善する

Experimental & Molecular Medicine volume 54、pages 2175–2187 (2022)この記事を引用

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過剰な心臓線維症は、多くの心疾患において心不全を引き起こす有害な心臓リモデリングおよび機能不全の中心となります。ヒストンのメチル化は、さまざまな病態生理学的イベントにおいて重要な役割を果たします。しかし、病的心線維症におけるヒストンメチル化修飾酵素の役割は完全に解明される必要がある。今回我々は、ヒストン H3K4me2/me3 デメチラーゼであるリジンデメチラーゼ 5B (KDM5B) が病的心線維症の重要なエピジェネティックメディエーターであることを同定しました。 KDM5B の発現は、病理学的ストレスに応答して心臓線維芽細胞および心筋組織で上方制御されました。 KDM5B欠損症は、心臓線維化を顕著に改善し、心臓機能を改善し、心筋梗塞（MI）や圧力過負荷後の有害な心臓リモデリングを予防しました。 KDM5B ノックアウトまたは阻害剤による治療は、心臓線維芽細胞の線維形成促進性筋線維芽細胞への移行を抑制し、線維化反応を抑制しました。 KDM5B欠損はまた、心臓線維芽細胞の内皮様細胞への形質転換を促進し、心筋損傷に応答して血管新生を促進しました。機構的には、KDM5B は心線維症の抗線維化制御因子である活性化転写因子 3 (Atf3) のプロモーターに結合し、活性化された H3K4me2/3 修飾を脱メチル化することで ATF3 発現を阻害し、TGF-β シグナル伝達の活性化の強化と TGF-β シグナル伝達の過剰発現を引き起こしました。線維化促進遺伝子。私たちの研究は、KDM5B が病的な心線維症を促進し、心機能不全および心不全への介入の標的候補となることを示しています。

虚血性心疾患と肥大型心疾患は、心不全を引き起こす 2 つの最も顕著な心血管疾患であり、有害な心臓リモデリングという共通の病理学的特徴を共有しています。心臓線維症は、虚血、血行力学的過負荷、神経液性活性化、およびサイトカインによって引き起こされる、心臓発作によって誘発される有害な心臓リモデリングの極めて重要な特徴的な発現です1。心臓線維症は通常、筋線維芽細胞の過剰活性化と過剰な増殖を特徴とし、細胞外マトリックスタンパク質の合成と分解のバランスが崩れます2。適切な線維化は、心筋梗塞（MI）などの一部の状態で心臓の構造を維持して心破裂を防ぐのに有益ですが、線維化反応が過剰に活性化すると、局所または心筋全体にコラーゲン線維が過剰に沈着し、心筋構造が変化し、心筋コンプライアンスが低下します。その結果、心機能不全、不整脈、心不全が発症します3,4。病理学的心線維症が、虚血性および非虚血性心臓ストレス事象にさらされた患者の心不全における臨床転帰を媒介する主要な経路であることを、大量の文献が実証している5。しかし、心線維症に対する効果的な治療法は非常に限られており、病的心線維症の根底にある重要なメカニズムをさらに探究することが求められています。

心臓内の複数の種類の細胞の中で、心臓常在線維芽細胞が最も主要な筋線維芽細胞の供給源であると考えられており、成体マウスの心臓の全細胞の約 11% を占めます 6,7。通常の生理学的条件下では、線維芽細胞は静止状態にあります。しかし、損傷した心臓では、線維芽細胞が活性化筋線維芽細胞に分化転換し、複数の病理学的ストレスに応答して心臓リモデリングに大きく寄与します8。線維芽細胞は、心臓の線維化を媒介するだけでなく、特定の状況下で障害のある心臓を再構築することもできます。たとえば、以前の研究では、線維芽細胞が内皮表現型を採用し、血管新生を促進して損傷した心臓を修復できることが示されています9,10。したがって、ストレス条件下で線維芽細胞の運命を正確に制御することは、心機能を改善し、病的な心線維症を予防するために不可欠です。しかし、線維芽細胞の運命を制御し、その適切な活性化状態を維持するメカニズムはまだ完全には理解されていません。

心線維症の調節には複数の調節機構が関与しています11。ヒストンメチル化などのエピジェネティックな機構は、クロマチン構造と遺伝子発現の制御に重要な役割を果たしています12。さまざまな心臓細胞タイプのヒストンメチル化プロファイルの変化が、さまざまな病理学的刺激によって誘発される可能性があることが示されています 13。これらの変化は、線維芽細胞における線維症関連遺伝子の発現の増加など、心臓内の複数の細胞タイプの恒常性の不均衡に寄与する可能性があります 13。以前の研究では、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ DOT1L (テロメアサイレンシング 1 様の破壊因子) が、トランスフォーミング成長因子 β (TGF-β)/SMAD シグナル伝達の活性化を増強することによって心臓線維芽細胞の線維化促進反応に寄与していることが示されており、ヒストンのメチル化を操作することが示唆されています。このプロファイルは、病的な心臓線維症を克服する上で大きな可能性を秘めています。しかし、他のヒストンメチル化修飾酵素が細胞運命の制御や心臓線維芽細胞の線維形成促進性反応に重要な役割を果たすかどうかについては、さらに調査する必要がある。

リジン特異的デメチラーゼ 5B (KDM5B) は、PLU1 または十文字 AT リッチ相互作用ドメイン 1B (JARID1B) としても知られ、リジン 4 での H3 の転写活性化トリメチル化およびジメチル化 (H3K4me3 および H3K4me2) の脱メチル化を媒介し、標的遺伝子の発現15．いくつかの研究では、KDM5B の異常発現が腫瘍形成や炎症性疾患の促進を含む複数の疾患の発症に関連していることが実証されています 16,17。しかし、心血管疾患における KDM5B の役割はまだ不明です。今回、我々は、KDM5Bの欠失が心臓線維芽細胞の活性化を有意に阻害し、H3K4me2/3のメチル化レベルを上昇させ、心臓線維芽細胞における活性化転写因子3（ATF3）の発現を促進することにより血管新生を促進し、これにより病的な心臓線維化が抑制されることを発見した。心機能不全を予防しました。私たちの研究は、異常な心線維症の病因における KDM5B の重要なエピジェネティックな調節の役割を解明しました。

組換えマウス TGF-β タンパク質 (7666-MB) は、R&D Systems (ミネソタ州ミネアポリス) から購入しました。アンジオテンシン II (AngII) (CSN10313) は、CSNpharm (イリノイ州シカゴ) から購入しました。 α-平滑筋アクチン（α-SMA）（ab5694、イムノブロット分析用）、ホスホ-SMAD3（SMADファミリーメンバー3）（ab52093）、およびKDM5B（ab181089、免疫蛍光分析用）に対する抗体は、Abcam（ケンブリッジ、英国）から入手しました。）。 I 型コラーゲン (AB765p) に対する抗体は、Millipore (マサチューセッツ州ビレリカ) から入手しました。 α-SMA に対する抗体 (5228、免疫蛍光および免疫組織化学用) は Sigma-Aldrich (ダルムシュタット、ドイツ) から入手しました。 III 型コラーゲン (NB600-594) に対する抗体は、Novus Biologicals (コロラド州リトルトン) から入手しました。ホスホ-SMAD2 (SMAD ファミリーメンバー 2) (3108)、SMAD2 (5339)、SMAD3 (9523)、ホスホ-ERK (細胞外シグナル調節 MAP キナーゼ) (9106)、ERK (4696)、ホスホ-JNK (c -Jun N末端キナーゼ) (4668)、JNK (9252)、ホスホ-p38 (4511)、p38 (9212)、ホスホ-p65 (3033 S)、p65 (8242)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) (5174) および ATF3 (18665) は、Cell Signaling Technology (マサチューセッツ州ダンバーズ) から入手しました。 KDM5B に対する抗体 (A301-813A、イムノブロット分析用) は、Bether Laboratories (テキサス州モンゴメリー) から入手しました。

野生型 C57BL/6 マウスは、Sipper BK Laboratory Animals (上海、中国) から入手しました。 KDM5B ノックアウト (KO) マウスは、CRISPR/Cas9 システムを使用して生成されました。デメチラーゼ活性に関与する JmjC ドメインを含む 428 塩基が Kdm5b 遺伝子から欠失し、その結果 Kdm5b 遺伝子にフレームシフトが生じ、KDM5B の機能が喪失しました。すべてのマウスは、同済大学の実験動物センターで特定の無病原体レベルのバリア条件下で維持され、すべての実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドによって承認された手順に従って行われました。

ＡｎｇＩＩ誘発圧力過負荷のために、生理食塩水またはＡｎｇＩＩ（１０００ｎｇ／ｋｇ／分）の２８日間注入を含む浸透圧ミニポンプ（ＡｌｚｅｔＭｏｄｅｌ２００４；ＡｌｚａＣｏｒｐ）をマウスの皮下に埋め込んだ。 MI モデルの場合、前述のように左冠動脈前下行枝の永久結紮を実施しました 18。簡単に説明すると、イソフルランの吸入による麻酔後（O2 1.5 L/分のイソフルラン2.5 L/分）、呼吸補助のために小動物用人工呼吸器を用いて1回換気量0.45 mlで換気を行った。左開胸により胸腔を開いて心臓を露出させ、左前下行枝を8-0絹結紮で永久結紮した。胸部と皮膚は、それぞれ 5-0 結紮および 4-0 結紮を使用して閉じられました。気管チューブを取り外した後、完全な意識が回復するまで、マウスを 37 °C の加温パッド上に置きました。 AngII 注入または MI 手術後の実験スケジュールの最後に、ペントバルビタールナトリウム (70 mg/kg 体重) を腹腔内に過剰投与して麻酔をかけた後、すべてのマウスを頸椎脱臼により安楽死させ、その後心臓組織を解剖し、関連する実験調査を行った。。 M モードおよび 30 MHz 周波数プローブを備えた二次元心エコー検査 (Vevo 2100; VisualSonics) を使用して、事前にスケジュールされた時点で盲検法で麻酔をかけたマウスの心機能を測定しました。

マウスの左心室心筋から初代心臓線維芽細胞を単離しました。簡単に説明すると、生後 2 週間のマウスから解剖した心臓をハサミで約 1 mm3 サイズの小片に切り刻み、0.125% トリプシンを含む予熱した消化バッファーとともに 37 °C で 10 分間インキュベートしました。ピペットで繰り返し混合した後、上清を収集し、消化が完了するまで残りの組織を 4 ～ 5 回処理しました。心臓線維芽細胞画分を遠心分離によって収集し、10%ウシ胎児血清(Gibco、MA)を含むDMEMに再懸濁した。再懸濁した細胞を、加湿インキュベーター内の処理済み組織培養皿（Corning, NY）上に播種した。 Kdm5b サイレンシングには、事前に設計された 2 つの Kdm5b 特異的 siRNA または異なる企業 (Dharmacon、コロラド州、Santa Cruz Biotechnology、テキサス州) の異なる配列を標的とするコントロール siRNA を使用しました。メーカーのプロトコールに従って、リポフェクタミン RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific、MA) を利用して、接着性心臓線維芽細胞を Kdm5b siRNA またはコントロール siRNA でトランスフェクトしました。

全RNAを心筋組織または培養心臓線維芽細胞からTRIzol試薬（Invitrogen、カリフォルニア州）を用いて抽出し、First Strand cDNA合成キット（TOYOBO、上海、中国）を用いてメーカーのプロトコールに従って逆転写した。各サンプルの cDNA を使用して、QuantStudio 6 (Applied Biosystems、Thermo Fisher Scientific) を使用してさまざまな遺伝子の発現の変化を評価しました。データは、Gapdh 発現に対して正規化されました。

マイクロアレイ解析は、Agilent Whole Mouse Genome 4 × 44 K アレイを使用して実行されました。メーカーの標準操作手順に従って、TAKARA RNAiso (TAKARA、大連、中国) を使用してサンプルから全 RNA を抽出しました。全 RNA は、Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies、CA) 電気泳動によって品質チェックされ、RNeasy ミニキット (QIAGEN、デュッセルドルフ、ドイツ) および RNase-Free DNase Set (QIAGEN) を使用して精製されました。標識、ハイブリダイゼーション、および洗浄は、Agilent のガイドラインに従って実行されました。完成したハイブリダイズしたマイクロアレイを、Agilent Microarray Scanner (Agilent Technologies, CA) を使用してスキャンしました。マイクロアレイシグナルおよびバックグラウンド情報は、Feature Extraction Software 10.7 (Agilent Technologies) を使用して取得し、GeneSpring Software 12.6.1 (Agilent Technologies) を使用して正規化しました。差次的発現のカットオフは、絶対倍率変化 > 2 および補正された p 値 < 0.05 として設定されました。トランスクリプトームマイクロアレイデータは、Gene Expression Omnibus でアクセッション番号 GSE197223 として入手できます。

心臓線維芽細胞は、MI後7日目にKDM5Bノックアウトまたは同腹子WTマウスの左心室心筋から単離された。ライブラリ構築のために心臓線維芽細胞から RNA サンプルを単離し、Illumina NovaSeq 6000 で配列決定して 150 bp のペアエンドリードを生成しました。 HISAT2 をデフォルトのパラメーターで使用して、リードを参照マウスゲノム (mm10) にマッピングしました。 100 万マッピングされたリードあたりの転写産物のキロベースあたりのフラグメント (FPKM) 値を使用して、差次的な遺伝子発現を評価しました。差次的に発現された遺伝子のクラスタリング、遺伝子オントロジー (GO) 機能強化分析、およびその他のデータ分析は、カスタムプログラムを使用して実行されました。 RNA 配列データは、Gene Expression Omnibus でアクセッション番号 GSE213746 として入手できます。

48 ウェルプレートを Growth Factor Reduced Corning Matrigel Matrix (Corning Life Sciences, MA) でコーティングし、メーカーのプロトコールに従って 37 °C で 30 分間重合させました。 KDM5B-KOマウスおよび同腹子WTマウスから単離した等量の培養心臓線維芽細胞をトリプシン処理し、コーティングされたプレートに播種した。 4 ～ 6 時間のインキュベーション後、心臓線維芽細胞による管形成の写真を撮影しました。

プロテアーゼ阻害剤カクテル（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）およびフッ化フェニルメチルスルホニルを含む細胞溶解緩衝液（Cell Signaling Technology）を用いて、心筋組織または培養心臓線維芽細胞から総タンパク質を抽出した。抽出されたタンパク質の濃度は、Pierce BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Fisher Scientific)を用いて測定した。等量のタンパク質を使用してイムノブロット分析を実行しました。

単離された心臓は、前述のようにパラフィン切片法を使用して組織学的分析のために準備されました19。簡単に説明すると、採取した心臓を 4% パラホルムアルデヒドで固定し、その後脱水し、パラフィンに包埋し、一連の 5 μm 厚の切片に切断しました。製造業者の指示に従ってトリクローム染色キットを使用することにより、線維性瘢痕領域を評価するためにマッソンのトリクローム染色を実施した。免疫蛍光および免疫組織化学的染色は、以前に記載されているように実行されました10。デジタル画像は、Leica 顕微鏡システム (Wetzlar、ドイツ) を使用して取得されました。

心臓線維芽細胞は、1% (vol/vol) ホルムアルデヒドを使用して架橋され、反応は 0.125 M グリシンで停止されました。次に、採取した架橋細胞内のタンパク質-DNA 複合体を氷水中で超音波処理して、サイズ 200 bp ～ 500 bp のランダムな断片を形成しました。上清抽出物を遠心分離により回収し、クロマチン免疫沈降キット（Millipore）のプロトコールに従ってChIP分析を行った。入力DNAおよび回収されたDNA免疫複合体中の標的遺伝子プロモーター配列をQ-PCRによって検出した。データは、対応する DNA 入力コントロールに対して正規化されました。マウスAtf3遺伝子プロモーターを検出するために使用したプライマーは以下の通りである:5'-TGACAGGGGCCATTTGAG AAATC-3'(フォワード)および5'-CCTCTGAGCAACTCCACAGAGCA-3'(リバース)。

2 つのグループ間の差異の統計的有意性は、対応のないスチューデントの t 検定によって決定されました。 3 つ以上のグループを比較する場合は、最小有意差 t 検定による一元配置または二元配置分散分析 (ANOVA) を実行しました。データは Prism 7 (GraphPad) で分析され、p 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

心筋損傷後の心線維化の進行を調節するヒストンメチル化修飾酵素をスクリーニングするために、我々はまず、MIまたは圧力過負荷後の心筋組織におけるそれらの発現の変化を測定した。これらのヒストンメチル化修飾酵素の中で、Kdm5b mRNA発現の増加は、MI後のマウスの虚血心筋において最も顕著でした（図1a）。心筋におけるKDM5B発現は時間依存的に上方制御され、MI後7日目にピークに達しました（図1b、c）。圧力過負荷に応答したKDM5B発現の変化をさらに観察し、AngII注入誘発性圧力過負荷後にKdm5b発現が心筋で顕著に上昇することを発見しました（図1d）。次に、病的ストレス後の心筋における KDM5B 発現の増加に寄与する細胞の種類を決定しました。免疫蛍光分析により、KDM5B発現の増加は主にα-SMA陽性心臓線維芽細胞に分布したが、MIまたはAngII注入を受けた心筋組織の心筋細胞には分布しなかったことが示された（図1e、fおよび補足図1a〜d）。さらに、TGF-β処理により、マウス心筋から単離された初代心臓線維芽細胞におけるKDM5BのmRNAおよびタンパク質の発現レベルが増加しました（補足図1e、f）。これらの結果は、心臓線維芽細胞で増加するヒストン脱メチル化酵素 KDM5B が、さまざまな種類の心筋損傷に応答する病理学的プロセスに関与していることを示唆しています。

MIまたは偽手術後7日目のWTマウスの心筋組織におけるメチル化修飾酵素のmRNA発現レベルのQ-PCR分析（偽手術群ではn = 3、MIグループではn = 4）。 b、c MIまたは偽手術後の示された日のKdm5b mRNAのQ-PCR分析（グループあたり n = 6マウス）、またはWTマウスの心筋組織におけるKDM5Bタンパク質発現の免疫ブロット分析。 # はマウスのシリアル番号を示します。 d AngIIまたは生理食塩水（NS）注入後28日目のWTマウスの心筋組織におけるKdm5b mRNA発現のQ-PCR分析（グループあたりn = 6マウス）。 e MIまたは偽手術後7日目のWTマウスの心筋組織におけるKDM5B（赤）またはα-SMA（緑）の代表的な免疫蛍光染色。スケールバー、50 μm (拡大: 10 μm)。 f AngIIまたはNS注入後28日目のWTマウスの心筋組織におけるKDM5B（赤）またはα-SMA（緑）の代表的な免疫蛍光染色。スケールバー、50 μm (拡大: 10 μm)。 *p < 0.05、***p < 0.001。対応のないスチューデントの t 検定 (a、d) または一元配置分散分析 (b) を実行しました。

C57BL / 6バックグラウンドのKDM5B欠損マウスは、デメチラーゼ活性とそれに伴うKdm5b遺伝子のフレームシフト変異の原因となるJmjcドメインの428 bpの欠失を媒介するCRISPR / Cas9システムを使用して生成されました（補足図2a））。 KDM5B-KO マウスの心臓線維芽細胞では、KDM5B の mRNA またはタンパク質の発現はほとんどありませんでした（補足図 2b、c）。さらに、免疫蛍光染色では、KDM5B欠損心臓線維芽細胞の核におけるKDM5Bの発現は示されませんでした（補足図2d）。心エコー検査分析では、生理学的条件下でKDM5B-KOマウスと対照同腹子WTマウスの間で心機能に違いがないことが示されました（補足図2e、f）。マッソントリクローム染色は、KDM5B欠損マウスが生理学的条件下でWTマウスと比較して有害な心臓リモデリングを示さないことを示唆しました（補足図2g）。次に、心機能およびMI後のリモデリングにおけるKDM5Bの役割を調査しました。 KDM5B-KOマウスは、MI後14〜28日目に、対照同腹子WTマウスと比較して、左心室駆出率（LVEF）および左心室短縮率（LVFS）の割合の増加を示しました（図2a）。 MI後のKDM5B-KOマウスでは左心室寸法と左心室容積の減少も観察され（図2aおよび補足図3a）、KDM5B欠損症が収縮機能を改善し、MI後の心臓の左心室拡張を減少させたことを示しています。 KDM5B欠損症は、心臓重量対体重（HW / BW）および心臓重量対脛骨長（HW / TL）比を減少させました（補足図3b、c）。マッソントリクロームおよびシリウスレッド染色により、MI後のWTマウスと比較して、KDM5B-KOマウスの心筋の瘢痕および線維症領域が著しく減少していることが明らかになりました（図2b〜e）。 I 型コラーゲンアルファ 1 鎖 (Col1a1)、III 型コラーゲンアルファ 1 鎖 (Col3a1)、フィブロネクチン 1 (Fn1)、細胞通信ネットワーク因子 2 (Ccn2)、Tgfb、アクチンなどの線維症関連遺伝子の mRNA 発現レベル心筋内のα 2 平滑筋（Acta2）は、KDM5B 欠損によって劇的に抑制されました（図 2f および補足図 3d）。免疫蛍光および免疫組織化学染色により、心筋内のα-SMA陽性筋線維芽細胞の数が限られており、KDM5B-KOマウスの筋線維芽細胞におけるコラーゲンIIIの発現が減少していることが示されました（図2gおよび補足図3e、f）。これらのデータは、KDM5Bが過剰活性化された筋線維芽細胞によって媒介される心臓線維症を悪化させ、MI後の心臓機能不全の悪化と有害な心臓リモデリングを引き起こすことを示しています。

a ベースライン（0日目）および表示された翌日のKDM5B-KOまたはWTマウスのLVEF、LVFS、左心室拡張末期内寸（LVIDd）、および左心室収縮末期内寸（LVID）の心エコー測定MI または偽手術 (1 グループあたり n = 6 匹のマウス)。 b – e MI後28日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織における代表的なマッソントリクローム染色画像と瘢痕サイズの定量（b、c）またはシリウスレッド染色画像と線維化領域の定量（d、e）。 n = 1 グループあたり 6 匹のマウス。スケールバー、1.6 mm (上)、200 μm (下)。 f MIまたは偽手術後14日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織におけるCol1a1およびCol3a1 mRNAレベルのQ-PCR分析（グループあたりn = 6マウス）。 g MI後14日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織におけるα-SMA（赤）およびCol III（緑）の代表的な免疫蛍光染色（グループあたりn = 6マウス）。スケールバー、50μm。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。対応のないスチューデントの t 検定 (c、e) または ANOVA (a、f) を実行しました。

我々は、圧力過負荷後の心機能と線維症における KDM5B の役割をさらに調査しました。 KDM5B欠損症は、AngII注入による圧力過負荷後の心機能を大幅に改善しました（図3a〜c）。 KDM5B欠損マウスは、体重に対する心臓重量および脛骨の長さの比の減少を示しました（図3d、e）。マッソントリクローム染色は、AngII注入を受けたWTマウスと比較して、KDM5B欠損マウスでは心筋の血管周囲および間質の線維症が劇的に軽減されたことを示しました（図3f-i）。 Acta2、Col1a1、Col3a1、結合組織増殖因子（Ctgf）などの線維症関連遺伝子のmRNAレベルは、AngII注入後のKDM5B欠損マウスの心筋組織で著しく減少しました（図3j）。 KDM5B欠損は、AngII注入後の心筋組織におけるコラーゲンIおよびコラーゲンIIIのタンパク質発現を阻害した（図3k）。免疫蛍光染色は、AngII注入後のKDM5B欠損マウスの心筋内の限られたα-SMA陽性筋線維芽細胞におけるコラーゲンIII産生の減少を示した（図3lおよび補足図3g）。これらの結果は、KDM5B 欠損が心臓機能不全、心臓線維症、および圧力過負荷によって引き起こされる病理学的リモデリングから保護することを示しています。

a AngIIまたは生理食塩水（NS）注入後28日目のKDM5B-KOマウスまたは同腹子対照WTマウスの左心室の代表的な心エコーMモード画像。 b、c AngIIまたはNS注入後28日目のKDM5B-KOまたはWTマウスのLVEF（b）およびLVFS（c）の心エコー測定（グループあたりn = 6マウス）。 d、e AngIIまたはNS後28日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの体重に対する心臓の重量の比（HW / BW）（d）および脛骨の長さに対する心臓の重量の比（HW / TL）（e）注入（各グループあたり n = 6 匹のマウス）。 f – i AngIIまたはNS注入後28日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織における代表的なマッソントリクローム画像および血管周囲（f、g）または間質（h、i）線維症の定量化（グループあたりn = 6マウス）。スケールバー、200 μm (左)、100 μm (右)。 j AngIIまたはNS注入後28日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織におけるActa2、Col1a1、Col3a1およびCtgf mRNA発現レベルのQ-PCR分析（グループあたりn = 6マウス）。 k AngIIまたはNS注入後28日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織におけるCol IおよびCol IIIタンパク質発現の免疫ブロット分析。 l AngII注入後28日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織におけるα-SMA（赤）およびCol III（緑）の代表的な免疫蛍光染色。スケールバー、50μm。 *p < 0.05、**p < 0.01。対応のないスチューデントの t 検定 (g、i) または一元配置分散分析 (b–e、j) を実行しました。

次に、線維芽細胞の線維化反応に対する KDM5B の影響を調査しました。 MI 後の KDM5B-KO および WT マウスの心筋組織から単離された初代心臓線維芽細胞のトランスクリプトームプロファイリングの特徴を特定するために、RNA-seq 分析が実行されました。遺伝子セット濃縮分析（GSEA）は、KDM5B-KO マウスが、有害な心臓リモデリングと心臓線維症の2つの主要な特徴であるコラーゲン原線維組織と細胞外マトリックス組織に関連する遺伝子の発現の減少を示すことを示唆しました（補足図4a〜d）。 KDM5B-KO および WT マウスの心筋組織から単離された初代心臓線維芽細胞を、インビトロで線維化促進因子 TGF-β で処理しました。 Col1a1、Col3a1、Fn1、およびCcn2を含む線維症関連遺伝子のmRNA発現レベルは、TGF-βに応答してKDM5B欠損心臓線維芽細胞において顕著に減少した（図4a）。一貫して、TGF-β刺激後のKDM5B欠損心臓線維芽細胞では、コラーゲンIおよびコラーゲンIIIのタンパク質発現レベルの抑制が観察されました（図4b）。これらの線維症関連分子の発現レベルの同様の減少は、TGF-βに応答して2種類の特定のsiRNAによって媒介されるKdm5bノックダウンを伴う心臓線維芽細胞でも観察されました（図4c、dおよび補足図5a〜c）。 GSK467 は、KDM5B20 の強力かつ選択的な阻害剤として同定されました。 GSK467での処理後、心臓線維芽細胞におけるCol1a1、Col3a1、Fn1、およびCcn2のmRNAレベル、およびTGF-βによって誘導されるコラーゲンIおよびコラーゲンIIIのタンパク質レベルは有意に阻害されました（図4e、f）。線維芽細胞から線維化促進表現型を有する筋線維芽細胞への形質転換は、α-SMA の発現増加と多数のアクチンマイクロフィラメント束の形成における形態学的変化によって特徴付けられます 21。免疫蛍光染色により、KDM5B欠損心臓線維芽細胞およびTGF-β刺激後のKdm5bノックダウンまたはGSK467処理による野生型線維芽細胞において、α-SMAの生成が著しく抑制され、線維芽細胞の形態が保存されていることが示されました（図4g-iおよび補足図5d）。これらの結果は、KDM5B が筋線維芽細胞の表現型の形成と心臓線維芽細胞によって媒介される線維症の進行を促進することを示しています。

a、b KDM5B 欠損 (KO) または同腹子における Col1a1、Col3a1、Fn1 および Ccn2 mRNA 発現の Q-PCR 分析 (a) (グループあたり n = 6) または Col I および Col III タンパク質発現の免疫ブロット分析 (b) TGF-β (10 ng/ml) で 24 時間刺激した対照 WT 心臓線維芽細胞。 c、d Col1a1、Col3a1、Fn1およびCcn2 mRNA発現のQ-PCR分析（c）（グループあたりn = 6）またはKdm5bサイレンシングまたはコントロールsiRNAトランスフェクトにおけるCol IおよびCol IIIタンパク質発現の免疫ブロット分析（d） TGF-β (10 ng/ml) で 24 時間刺激した心臓線維芽細胞。 e、f KDM5B阻害剤GSK467で処理した心臓線維芽細胞におけるCol1a1、Col3a1、Fn1およびCcn2 mRNA発現のQ-PCR分析（e）（グループあたりn = 6）またはCol IおよびCol IIIタンパク質発現の免疫ブロット分析（f）またはDMSOで刺激した後、TGF-β (10 ng/ml)で24時間刺激します。 g – i KDM5B 欠損 (g)、KDM5B ノックダウン (h)、または GSK467 治療 (i) の心臓線維芽細胞および TGF で刺激された対応する対照心臓線維芽細胞 (g – i) における α-SMA (赤) の代表的な免疫蛍光染色。 β (10 ng/ml) を 24 時間。同様の結果が 3 つの独立した実験 (g–i) からも得られました。スケールバー、50μm。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。対応のないスチューデントの t 検定 (a、c、e) を実行しました。

SMAD依存性またはSMAD非依存性のTGF-βシグナル伝達経路の活性化は、線維症の必須の決定因子です。 SMAD2およびSMAD3リン酸化の抑制は、MI後のKDM5B-KOマウスの心筋組織におけるSMAD依存性TGF-βシグナル伝達の活性化の減少を示した（図5a）。 ERK、JNK、p38およびp65のリン酸化を含む、SMAD非依存性TGF-βシグナル伝達の活性化は、MI後のKDM5B-KOマウスの心筋組織において損なわれた（図5b）。一貫して、SMAD2、SMAD3、ERK、JNK、p38、および p65 のリン酸化の減少によって示されるように、SMAD 依存性または SMAD 非依存性の TGF-β シグナル伝達の活性化の抑制が、AngII 注入後の KDM5B-KO マウスの心筋組織で観察されました。図5c、d)。さらに、KDM5B欠損またはノックダウンは、初代心臓線維芽細胞においてTGF-βによって誘導されるSMAD2、SMAD3、ERK、JNK、p38およびp65の活性化を顕著に抑制した（図5e〜fおよび補足図6a、b）。これらのデータは、KDM5Bが病的状態下でSMAD依存性またはSMAD非依存性のTGF-βシグナル伝達活性化を増強することにより、線維化反応および心臓線維芽細胞の移行を促進することを示している。

MIまたは偽手術後のKDM5B-KOマウスまたは同腹子対照WTマウスの心筋組織の溶解物中のSMAD2およびSMAD3タンパク質のリン酸化（p-）レベルまたは総レベルの免疫ブロット分析。 b MIまたは偽手術後のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織の溶解物中のERK、JNK、p38およびp65タンパク質のリン酸化レベルまたは総レベルの免疫ブロット分析。 c AngIIまたは生理食塩水（NS）注入後のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織の溶解物中のSMAD2およびSMAD3タンパク質のリン酸化レベルまたは総レベルの免疫ブロット分析。 d AngIIまたは生理食塩水（NS）注入後のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織の溶解物中のERK、JNK、p38およびp65タンパク質のリン酸化レベルまたは総レベルの免疫ブロット分析。 e 示された時間TGF-β（10ng/ml）で処理したKDM5B-KOまたはWTマウスからの心臓線維芽細胞の溶解物中のSMAD2およびSMAD3タンパク質のリン酸化レベルまたは総レベルの免疫ブロット分析。 f TGF-β（10 ng/ml）で示された時間処理したKDM5B-KOまたはWTマウスからの心臓線維芽細胞の溶解物中のERK、JNK、p38およびp65タンパク質のリン酸化レベルまたは総レベルの免疫ブロット分析。同様の結果が 3 つの独立した実験からも得られました。

これまでの研究では、血管新生が、MI および AngII 誘発性の圧力過負荷後の心機能不全と有害な心臓リモデリングを改善することが実証されています 22,23。 MI後のKDM5B-KOマウスおよび対照同腹子WTマウスの心筋組織からのRNAのマイクロアレイ分析は、血管新生に関連する差次的に発現された遺伝子の富化を示した（補足図7a）。さらに、MI後のKDM5B-KOマウスの心筋組織では、正に制御された血管新生関連遺伝子の発現増加と負に制御された血管新生関連遺伝子の発現減少が観察されました（補足図7b）。 KDM5B欠損症は、心筋における血管内皮増殖因子A（Vegfa）、Cd31、血管内皮増殖因子受容体2（Vegfr2）、一酸化窒素合成酵素3（Nos3）、フォン・ヴィレブランド因子（Vwf）などの内皮マーカー遺伝子の発現レベルを亢進した。 MI後の組織（図6a）。線維芽細胞から内皮細胞への移行によって媒介される血管新生は、心筋損傷後の心臓の修復を促進することが報告されています9。マイクロアレイ分析と一致して、KDM5B-KOおよびWTマウスの心筋組織から単離された線維芽細胞のさらなるRNA-seq分析は、MI後の血管新生に関連する差次的に発現された遺伝子の濃縮を示した（図6b）。 GSEAは、MI後のWTマウスと比較して、KDM5B-KOマウスの心臓線維芽細胞において、広く認識されている血管新生促進性VEGFシグナル伝達経路に富む、有意に上方制御された遺伝子セットを示した（図6c）。さらに、明らかにされた上位の差次的発現遺伝子は、MI後のKDM5B-KOマウスの心臓線維芽細胞における正に制御された血管新生関連遺伝子の発現増加と負に制御された血管新生関連遺伝子の発現減少であった（図6d）。さらに、遺伝子変化検出のために、MI後7日目にKDM5B-KOマウスおよびWTマウスの心筋組織から心筋細胞および心臓線維芽細胞を単離した。補足図7cに示すように、KDM5B欠損は心筋細胞における血管新生関連遺伝子の発現には影響を及ぼさなかったが、心臓線維芽細胞における発現レベルは増加した。免疫蛍光染色は、MI後のKDM5B-KOマウスの心筋組織においてビメンチン陽性心臓線維芽細胞と共局在するVEGFRまたはIB4の発現増加を示した（図6e、fおよび補足図7d、e）。 KDM5B欠損により、KDM5B-KOマウスの心筋組織から単離された初代心臓線維芽細胞におけるVegfa、Cd31、Vegfr2、Nos3、Vwfなどの内皮マーカー遺伝子の発現レベルが増加しました（図6g）。 KDM5B欠損症は、初代心臓線維芽細胞によって媒介される管形成を促進しました（補足図7f）。これらのデータは、KDM5B の喪失により線維芽細胞の内皮様細胞への移行が促進され、血管新生が強化され、病理学的損傷に応じた心臓の線維化と機能不全が軽減されることが示されています。

MI手術後7日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織におけるVegfa、Cd31、Vegfr2、Nos3およびVwf mRNAレベルのQ-PCR分析（各グループn = 6マウス）。 b MI手術後7日目のKDM5B-KOマウスおよび同腹子対照WTマウスの心臓組織から単離された初代心臓線維芽細胞における差次的に発現された上位15遺伝子を示す遺伝子オントロジー濃縮分析（BP生物学的プロセス、CC細胞成分、MF分子機能）。 c bと同様、初代心臓線維芽細胞におけるVEGFシグナル伝達経路に関連する遺伝子セットを示すGSEA濃縮プロット。 d bと同様、初代心臓線維芽細胞における血管新生の正および負の調節と比較して差次的に発現された遺伝子を示すヒートマップ。 e、f MI手術後7日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織におけるVEGFR（緑色）（e）、IB4（緑色）（f）およびビメンチン（赤色）（e、f）の代表的な免疫蛍光染色。スケールバー、50μm。同様の結果が 3 つの独立した実験からも得られました。 g TGF-β（10 ng/ml）で24時間刺激したKDM5B欠損（KO）またはWT心臓線維芽細胞におけるVegfa、Cd31、Vegfr2、Nos3およびVwf mRNA発現のQ-PCR分析（グループあたりn = 4）。 *p < 0.05、**p < 0.01。対応のないスチューデントの t 検定 (a、g) を実行しました。

我々は、KDM5B欠損によって媒介される心臓線維症の軽減と機能不全の根底にあるメカニズムをさらに調査しました。 MI後のKDM5B-KOマウスおよび対照同腹子WTマウスの心筋組織のRNAからスクリーニングされた上位の上方制御発現遺伝子の中で、KDM5B-KOマウスの心筋組織におけるAtf3発現の顕著な増加は、我々の注目を集めた（図7a）。一貫して、RNA-seq分析は、KDM5B欠損心臓線維芽細胞におけるAtf3の発現の増加を示しました（補足図8a）。これまでの研究では、心臓線維芽細胞におけるATF3発現の上昇により、有害な心臓リモデリングが防止され、虚血性または肥大性損傷によって誘発される心筋線維症が抑制されることが示されています24,25。野生型マウスの心筋組織におけるAtf3発現は、MI後1日目にピークに達し、その後、3〜7日目には比較的高いレベルまで減少した(図7b)。 KDM5B欠損により、MI後の心筋組織におけるATF3のmRNAおよびタンパク質の発現が増加しました（図7c、d）。 TGF-βで刺激された初代心臓線維芽細胞におけるATF3のmRNAおよびタンパク質レベルは、Kdm5bノックダウンまたはGSK467阻害剤治療によって上方制御されました（図7e〜hおよび補足図8b、c）。 TGF-βによって誘導された初代心臓線維芽細胞におけるCol1a1、Col3a1、Fn1、Ccn2などの線維化関連遺伝子の発現レベルは、Kdm5bノックダウン後に有意に低下するか、Atf3ノックダウン単独後に増加したが、これらの線維化遺伝子の発現低下は、 Kdm5bのノックダウンは、Atf3のノックダウンによって逆転することができた(図7i、j)。これらのデータは、ATF3 が KDM5B の下流標的であり、KDM5B 欠損が ATF3 発現を増加させることによって心線維化を軽減することを示しています。

MI手術後7日目のKDM5B-KOマウスおよび同腹子対照WTマウスの心筋組織において発現が上方制御された上位20遺伝子を示すヒートマップ。 b MIまたは偽手術後の示された日のWTマウスの心筋組織におけるAtf3およびKdm5b mRNA発現のQ-PCR分析（グループあたりn = 6）。 #p < 0.05 対偽手術グループの Kdm5b mRNA レベル。 *p < 0.05、**p < 0.01 対偽手術グループの Atf3 mRNA レベル。 c、d MI手術後7日目のKDM5B-KOまたはWTマウスの心筋組織におけるAtf3 mRNAのQ-PCR分析（c）（グループあたり n = 6マウス）またはATF3タンパク質レベルの免疫ブロット分析（d）。 e、f TGF-β（10 ng）で刺激したKdm5bサイレンシングまたは対照siRNAトランスフェクト心臓線維芽細胞におけるAtf3 mRNA発現のQ-PCR分析（e）（グループあたりn = 6）またはATF3タンパク質発現の免疫ブロット分析（f） /ml）24時間。 g、h KDM5B 阻害剤 GSK467 または DMSO で処理し、その後 TGF-β で刺激した心臓線維芽細胞における Atf3 mRNA 発現の Q-PCR 分析 (g) (グループあたり n = 6) または ATF3 タンパク質発現の免疫ブロット分析 (h) 10 ng/ml) 24 時間。 i Atf3 siRNAまたはコントロールsiRNAをトランスフェクトした心臓線維芽細胞におけるATF3タンパク質発現の免疫ブロット分析。 j Kdm5b siRNA、Atf3 siRNA、コントロール siRNA でトランスフェクトされた、または Kdm5b と Atf3 siRNA で同時トランスフェクトされ、その後 TGF-β (10 ng/ml) で刺激された心臓線維芽細胞における Col1a1、Col3a1、Fn1 および Ccn2 mRNA 発現レベルの Q-PCR 分析。 24 時間 (グループあたり n = 6)。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。対応のないスチューデントの t 検定 (c、e、g) および ANOVA (b、j) を実行しました。

KDM5B はヒストン H3K4me3 および H3K4me2 デメチラーゼ 15 であるため、次に、KDM5B がヒストン H3K4 のメチル化レベルに影響を与えることによって ATF3 発現を調節するかどうかを調べました。 Atf3 プロモーターへの KDM5B の動員は、TGF-β 刺激後の心臓線維芽細胞において顕著に増強されました (図 8a)。 KDM5B-KOマウスの心筋組織から単離された心臓線維芽細胞では、H3K4me2およびH3K4me3レベルの顕著な増加が観察された（図8b）。一貫して、Kdm5bノックダウンまたはGSK467処理は、TGF-βで刺激された野生型心臓線維芽細胞におけるH3K4me2およびH3K4me3のレベルを上昇させた（図8c、d）。 TGF-βで24時間刺激した後の野生型心臓線維芽細胞では、Atf3遺伝子のプロモーターにおけるH3K4me2およびH3K4me3のレベルの低下が見られました（図8e、f）。対照的に、KDM5B欠損は、TGF-β処理に応答して、心臓線維芽細胞のAtf3遺伝子のプロモーターにおけるH3K4me2およびH3K4me3のレベルを顕著に増加させた（図8g、h）。これらの結果は、KDM5BがAtf3プロモーターに直接結合し、そのヒストンデメチラーゼ活性を介してATF3転写を阻害し、その結果、心線維症と、MIおよび圧力過負荷後の有害な心臓リモデリングを悪化させることを示しています（補足図9）。

TGF-β (10 ng/ml) またはコントロール PBS (Ctrl) で 24 時間処理した WT 心臓線維芽細胞における Atf3 プロモーターでの KDM5B 濃縮レベルの ChIP 分析。グループあたり n = 6。 b〜d KDM5B欠損症（b）、KDM5Bノックダウン（c）またはGSK467治療（d）、およびTGF-β（10ng）で刺激した対応する対照心臓線維芽細胞（b〜d）の心臓線維芽細胞におけるH3K4me2およびH3K4me3レベルの免疫ブロット分析/ml) を指定の時間使用します。同様の結果が 3 つの独立した実験からも得られました。 e、f TGF-β（10ng/ml）またはコントロールPBS（Ctrl）で24時間処理したWT心臓線維芽細胞のAtf3プロモーターにおけるH3K4me2（e）またはH3K4me3（f）レベルのChIP分析。グループあたり n = 6。 g、h TGF-β（10 ng/ml）で24時間刺激したKDM5B欠損（KO）またはWT心臓線維芽細胞のAtf3プロモーターにおけるH3K4me2（g）またはH3K4me3（h）レベルのChIP分析。グループあたり n = 6。 *p < 0.05、***p < 0.001。二元配置分散分析 (a、e – h) を実行しました。

心線維症は、多くの心疾患の最も一般的な病理学的特徴であり、心不全などの予後不良と関連しています。この研究では、心臓線維症の発症促進におけるヒストン脱メチル化酵素 KDM5B の新たな役割を明らかにしました。 KDM5B は、Atf3 プロモーター上で活性化された H3K4me2/3 の脱メチル化を媒介し、Atf3 発現を抑制し、過剰な心臓線維症と、虚血性および肥大型発作後の心機能の低下を引き起こします。

複数の病原性遺伝子の異常発現は、心疾患の発症および進行と密接に関連しています。ヒストンの異なるエピジェネティックな修飾と部位は、これらの病原性遺伝子の転写の制御において重要かつ正確な役割を果たしています 26。さまざまな種類のヒストン修飾の中でも、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼによって媒介される可逆的なメチル化修飾プロファイルは、複数の生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な機能を持っています27。以前の研究では、H3K9 のモノ/ジメチル化を媒介するメチルトランスフェラーゼである G9a が筋細胞エンハンサー因子 2C (MEF2C) と複合体を形成し、ヘテロクロマチンに結合して心線維症を抑制することが示されました 28。内皮特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼ SET ドメイン含有 1 (SET1) のサイレンシングは、慢性 AngII 治療に応答してエンドセリン 1 転写を抑制することにより、心線維症と心肥大を阻害する可能性があります 29。しかし、病的心線維症におけるヒストンデメチラーゼの役割に関する研究は限られています。ミオカルディン関連転写因子 A (MRTF-A) は、リジンデメチラーゼ 3A (KDM3A) と相互作用することによりマクロファージの輸送を促進し、心臓の線維化と肥大を悪化させますが、KDM3A がデメチラーゼ活性に依存して機能するかどうかは不明のままです 30。重要なヒストン H3K4me2/3 デメチラーゼ KDM5B については、その機能に関するこれまでの研究は腫瘍疾患および感染症に焦点を当ててきました。例えば、KDM5B は、SETDB1 (SET ドメイン分岐ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ 1) を動員してレトロエレメントを沈黙させることにより、黒色腫における抗腫瘍免疫を抑制し、免疫回避を媒介しました 31。 KDM5B 欠損は、炎症性サイトカインの産生を有意に促進し、さまざまな病原体によって引き起こされる先天性炎症反応を促進しました 17,32。我々の研究は、KDM5BがAtf3プロモーター上で活性化されたH3K4me2/3の脱メチル化を媒介し、その発現を阻害することによって病的心線維症の進行を促進するという証拠を提供する。したがって、我々の発見は、KDM5Bが新規な線維化促進性ヒストンデメチラーゼであることを特定し、病的ストレス条件下での心臓線維症に対する新しいエピジェネティックな制御アプローチを明らかにする。

心線維症の主な症状は、過剰な合成と細胞外マトリックスの不十分な分解を伴う線維芽細胞から筋線維芽細胞への過剰な変換であり、これにより心筋コンプライアンスの低下、拡張期収縮機能不全、さらには心不全の発症につながります2。病理学的心線維症は、複数の線維性シグナル伝達経路の転写制御に依存しており、そのうちの転写因子はシグナル成分の活性化において重要な制御役割を果たしています 33。この研究では、病的条件下で KDM5B 欠損マウスの心筋において ATF3 発現が顕著に増加していることを発見しました。さらに、KDM5B欠損がプロモーター領域の活性化H3K4me2/3メチル化レベルを上昇させることによりATF3発現を促進することを実証した。これらの結果は、転写因子 ATF3 が心線維症における KDM5B の必須の下流標的であることを裏付けています。これまでの研究では、ATF3 がさまざまな臓器の線維症において二重の役割を果たすことが示されています。蓄積されている証拠により、ATF3 が心臓線維化の進行を制限し、虚血性損傷または肥大性損傷によって引き起こされる有害な心臓リモデリングを防止することが実証されています 24,25,34。しかし、ATF3 の過剰発現は線維化肝臓で見つかり、肝星細胞を活性化することによって肝線維化に寄与しました 35。さらに、ATF3 は、全身性硬化症およびブレオマイシン誘発性肺損傷において線維化促進の役割を果たしています 36,37。臓器線維症における ATF3 の機能の違いは、異なる細胞型および線維化促進機構に関連している可能性があります。心臓に関する以前の報告と一致して、我々のデータは、KDM5Bによってエピジェネティックに抑制される重要な調節因子であるATF3が、虚血性ストレスまたは肥大性ストレスに応答して心臓線維芽細胞によって媒介される心筋線維症を阻害できることを確認しています。

心筋細胞の再生能力は極めて低いため、虚血性疾患における心筋損傷後の修復には、梗塞領域の血流ネットワークの再構築と修復が重要です。心臓の血管新生は、心機能と心筋の圧力過負荷への適応を維持するために重要です 23,38。内皮細胞は血管新生を媒介する最も重要な細胞であると考えられていますが、線維芽細胞の寄与を無視すべきではありません。線維芽細胞はパラクリン分泌を通じて内皮細胞媒介血管新生を促進し、内皮細胞に分化転換して心臓損傷後の血管新生を媒介することができます9、39、40、41。私たちの研究は、KDM5B欠損が血管新生関連遺伝子の発現を増加させ、線維芽細胞から内皮様細胞への分化転換を促進し、それが血管新生を促進し、病的状態下での心機能不全の軽減に寄与するという証拠を提供している。 KDM5B欠損によって媒介される血管新生増強の根本的なメカニズムには、Nodalなどのいくつかの転写因子の発現制御が関与している可能性があり、さらなる研究が必要である。

エピジェネティック療法は、創薬における新規かつ価値のある研究分野として浮上しています。臨床試験におけるエピジェネティック修飾酵素のさまざまな調節因子の利用は、主に腫瘍学的疾患に焦点を当てています。例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ EZH2 (zeste 2 ポリコーム抑制複合体 2 サブユニットのエンハンサー) またはヒストンデメチラーゼ LSD1 (リシン特異的デメチラーゼ 1) の選択的阻害剤は、固形腫瘍または白血病において有望な抗腫瘍活性を示しました 42,43。しかし、がん以外の疾患、特に心血管疾患の臨床試験で有効な反応を示したエピジェネティック阻害剤はほとんどありません。我々の in vitro 結果により、線維芽細胞媒介の前線維化反応の抑制における KDM5B 阻害剤の有効性が確認されました。 KDM5B欠損によって媒介される心臓線維症の減弱を示すin vivoデータと併せて、我々の研究は、病的心線維症を克服するためのKDM5Bを標的としたエピジェネティック療法の開発に新たな道を開くものである。

要約すると、我々の結果は、ヒストンデメチラーゼKDM5Bがプロモーター上のH3K4me2/3を脱メチル化することによりATF3発現を抑制し、その後線維化促進性遺伝子の過剰発現を促進し、血管新生を阻害することを示している。 KDM5B は心臓線維症の進行を促進し、虚血性または肥大性ストレスに応答して有害な心臓リモデリングを促進します。これは、病的心臓線維症および心不全に対する新規エピジェネティック療法の開発に役立ちます。

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この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (2019YFA0801502)、中国国家自然科学財団 (82070415、82071790、82101842)、および上海教育開発財団と上海市教育委員会が後援する曙光プログラム (19SG17、 18SG33）。

中国教育省不整脈重点研究室、同済大学医学部上海東病院トランスレーショナル医学研究センター、200120、中国上海

ボー・ワン、ヨン・タン、シェン・ジャン、シュエウェン・ドゥアン、トン・リー、ジェンジェン・ジャン

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Yunkai Zhang、Yuyu Jiang、Xingguang Liu

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周清清 & 振振

上海交通大学医学部仁吉病院肝臓外科、上海移植研究所、200127、中国、上海

ジェン・ジェン

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BW、YT、YZ、SZ、XD、YJ、TL、QZ が実験を実行し、データを分析し、結果を解釈しました。 BW は原稿を作成し、統計分析を実行しました。 ZZ と XL はアイデアを考案し、実験を設計し、データを分析し、原稿を改訂し、この研究に資金を提供しました。すべての著者は、重要な知的内容について原稿を批判的に改訂しました。

Xingguang Liu または Zhenzhen Zhan への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Wang、B.、Tan、Y.、Zhang、Y. 他 KDM5B の喪失は、ATF3 発現をエピジェネティックに増強することにより、病的な心臓線維症と機能不全を改善します。 Exp Mol Med 54、2175–2187 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s12276-022-00904-y

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受信日: 2022 年 4 月 19 日

改訂日: 2022 年 9 月 26 日

受理日: 2022 年 10 月 24 日

公開日: 2022 年 12 月 8 日

発行日：2022年12月

DOI: https://doi.org/10.1038/s12276-022-00904-y

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KDM5Bの喪失はATF3発現をエピジェネティックに増強することにより病的な心臓線維症と機能不全を改善する